RAS 基因家族包括 HRAS、KRAS 和 NRAS。研究报道显示，KRAS 基因在多种癌症中具有较高的突变率，尤其在结直肠癌中，KRAS 基因突变较为突出 ^[1-2]。结直肠癌是我国第三大常见癌症，发病率和病死率较高 ^[3-4]。根据 2020 年的统计数据，中国结直肠癌的发病率和病死率在全球范围内分别位居第 2 位和第 5 位 ^[5]。晚期结直肠癌患者的治疗方法选择有限，但靶向治疗药物如西妥昔单抗（Cetuximab）的出现为结肠癌的治疗提供了新的治疗方向。目前，《国家卫健委中国结直肠癌诊疗规范（2023 版》推荐对结直肠癌患者进行 KRAS基因突变检测，以指导个性化治疗 ^[6]。KRAS 基因突变的检测技术包括高通量测序、Sanger 测序、突变扩增系统聚合酶链式反应（amplification refractory mutation system, Polymerase Chain Reaction ARMS-PCR）、GOLD-PCR、数字 PCR 和高分辨率熔解曲线分析法 ^[7-12]。尽管测序技术在准确度方面具有一定优势，但灵敏度欠佳。数字 PCR 虽然灵敏度高，但成本较高。实时荧光 PCR 技术以其高灵敏度、良好的特异度、简便的操作和较低的成本已经广泛应用于各大医院^[13]。近年来，随着个性化医疗技术的不断发展，KRAS 基因突变检测试剂盒的市场需求日益增长。

本研究依据国家药品监督管理局（Nationel Medical Products Administration，NMPA）发布的《肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则》^[14] （以下简称《指导原则》）对新开发的人KRAS 基因突变检测试剂盒（PCR- 荧光法）进行性能评价，旨在为结直肠癌患者的辅助诊断提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  一般材料

KRAS 基因突变标准物质：KRAS 基因突变标准物质是从 KRAS 基因突变细胞系中提取、纯化的全基因组 DNA，KRAS（G12S）、KRAS（G12R）、KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12A）、KRAS（G12V），标准物质购买于中国计量科学研究院；KRAS（G13D）、KRAS 野生型基因组 DNA标准物质购买于南京科佰生物科技有限公司 。结直肠癌临床样本：选择首都医科大学附属北京世纪坛医院（伦理审批件：2019 伦审第 46 号）、河南省肿瘤医院（伦理审批件：2019313）、河北医科大学第四医院（伦理审批件：2019073）的共计 1 048 例结直肠癌石蜡切片临床样本作为临床比对研究对象。其中，男 555 例（52.96%）、女 493 例（47.04%） ；年龄 20 ~ 96 岁，平均（60.76±12.71）岁；肿瘤部位：结肠 315 例，直肠 190 例，结直肠 543 例；病理组织学分化：低分化 151 例，中分化 357 例，中高分化 31 例；组织学分级：结直肠腺癌Ⅱ级317 例，结直肠腺癌Ⅱ ~ Ⅲ级 36 例。

纳入标准：诊断为结直肠癌患者的检测剩余组织切片样本。排除标准：石蜡切片样本保存时间超过 2 年，病例资料不全。

1.2  仪器与试剂

苏州华益美生物科技有限公司开发的人 KRAS基因突变检测试剂盒（PCR- 荧光法）（以下简称考核试剂），已获得江苏省医疗器械检验所的注册检定报告，报告编号为 2019ZC 类第 0163 号。本研究共计使用 3 批考核试剂。选择经 NMPA 批准的 K-ras 基因突变检测试剂盒（PCR- 荧光探针法）（北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，国械注准 20143402142）（以下简称对照试剂）为临床对比研究试剂。 核酸提取仪 BACME SLA-D14800（苏州华益美生物科技有限公司），实时荧光定量 PCR 仪 7500（Thermo Fisher Scientific），移液器（DRAGONLAB）。

1.3  方法

根据 NMPA 发布的《指导原则》^[14] 对考核试剂的准确度、特异度、检测限、精密度、一致性进行评估。

1.3.1  准确度

使用 5 ng/μl KRAS 野生型基因组 DNA 分别稀释 KRAS（G12S）、KRAS（G12R）、KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12A）、KRAS（G12V）、KRAS（G13D） 全基因组 DNA，使最终各反应体系中 KRAS（G12S）、KRAS（G12R）、KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12A）、KRAS（G12V）、KRAS（G13D）突变型含量均为 1%（样本编号为P1 ~ P7），采用考核试剂检测 P1 ~ P7 样本，检测结果应为突变阳性。

1.3.2  特异度

（1）交叉反应验证：使用 5 ng/μl KRAS 野生型基因组 DNA 稀释 KRAS（G12S）、KRAS（G12R）、KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12A）、KRAS（G12V）、KRAS（G13D）基因组 DNA，使最终各反应体系中突变型含量均为 10%（样本编号为 MN1 ~ MN7）。使用 3 批考核试剂对 5 ng/μl 的野生型基因组 DNA（NN1）和 MN1 ~ MN7 样本进行检测，检测结果应为各突变型间均无交叉干扰，野生型样本为阴性。（2）KRAS 同源基因及相关病原体检测：使用移液器将待验证的 HRAS、NRAS 基因及诺瓦克病毒、大肠杆菌等病原体加入5 ng/μl KRAS 野生型基因组 DNA 中（样本编号为N1 ~ N10），采用 3 批考核试剂对 N1 ~ N10 进行检测，结果应未检出突变。

1.3.3  检测限

检测限样本的配置：使用含有不同浓度的KRAS 野生型基因组 DNA（浓度为 20.00、2.50、0.50、0.10、0.05 ng/μl） 分 别稀释 KRAS 突变型基因组 DNA 至各突变型浓度为 10.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%。于扩增反应终体系特定核酸浓度下，突变百分率的最低检测限：采用 3 批考核试剂对检测限样本进行检测，采用 Probit 分析模型分析在扩增反应终体系特定核酸浓度下，突变百分率的 95%阳性检出率。 在特定突变百分率下，扩增反应终体系中核酸浓度的最低检测限：采用 3 批考核试剂对检测限样本进行检测，采用 Probit 分析模型分析在特定突变百分率下，扩增反应终体系中核酸浓度的 95% 阳性检出率。

1.3.4  精密度

使用 KRAS 野生型基因组 DNA 及 KRAS 突变型基因组 DNA 配置精密度样本，KJ1（5 ng/μl 总基因组 DNA，10% 突变率）、KJ2（5 ng/μl 总基因组DNA，1% 突变率）和 KJN（5 ng/μl KRAS 野生型基因组 DNA）。

使用 KJ1、KJ2、KJN 精密度样本对 3 批考核试剂进行为期 20 d 的检测。检测结果：KJN 精密度样本的阳性率应为 0%；KJ1 精密度样本的检测结果应全部为阳性，且各突变型 ∆Ct 变异系数（coefficient of variation，CV）应≤ 15%；KJ2 精密度样本的检测结果阳性率应为 100%。

1.3.5  一致性

使用考核试剂和对照试剂分别检测 1 048 例结直肠癌临床样本，采用交叉四格表计算考核试剂和对照试剂的阳性符合率、阴性符合率和总符合率，并对 2 种试剂的检测结果进行一致性分析。

1.4  统计学处理

使用 SPSS 22.0 软件对数据进行分析和处理，并应用 Kappa 检验比较 2 种试剂的检测一致性，Kappa ≥ 0.75 为具有较高一致性。

2  结果

2.1  准确度

3 批考核试剂检测 P1 ~ P7 样本，检测结果均为相应突变型，测试阳性符合率为 100%，见表 1。

表 1 准确度检测结果统计

2.2  特异度

（1）考核试剂覆盖范围内的所有突变类型进行交叉反应验证：3 批考核试剂检测 NN1、MN1 ~MN7 样本 , 检测结果均显示各突变型间无交叉干扰，野生型样本检测结果也均为阴性，见表 2。（2）KRAS 同源基因及相关病原体检测：3 批考核试剂检测 N1 ~ N10 样本的结果显示，同源基因及相关病原体均未检出突变，测试阴性符合率为 100%，见表 3。

表 2 考核试剂覆盖范围内所有突变类型的交叉反应验证结果

注：“+”表示检测结果为突变阳性，“-”表示检测结果为阴性，未检出突变

表 3 KRAS 同源基因及相关病原体特异度检测结果

2.3  检测限

（1）于扩增反应体系特定核酸含量条件下，各 KRAS 突变型在 10 ng/ 反应体系的突变百分率的 95% 检出率均值均 ≤ 1%， 见表 4。（2） 于特定突变比例条件下，各 KRAS 突变型 1% 突变比例的反应终体系核酸浓度的 95% 检出率均值均≤ 10 ng/ 反应体系，见表 5。因此，将考核试剂的检测限确定为 10 ng 反应体系可检出 1% 的KRAS 突变型。

表 4 特定核酸浓度下突变比例的最低检测限

2.4  精密度

3 批考核试剂检测 KJN 精密度样本的阳性率均为 0%；KJ1 精密度样本的检测结果全部为阳性，且各突变型 ∆Ct 的 CV ≤ 15%；KJ2 精密度样本的检测结果阳性率均为 100%。精密度检测结果符合《指导原则》 的要求，考核试剂精密度良好。

表 5 特定突变比例下反应体系终核酸浓度的最低检测限

2.5  一致性分析

两组试剂的阳性和阴性结果对比见表 6。考核试剂与对照试剂的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为 100%。Kappa 一致性检验结果显示，Kappa ≥ 0.75，考核试剂与对照试剂的检测结果具有高度一致性。

表 6 考核试剂与对照试剂检测结果比较

3  讨论

KRAS 基因突变检测在结直肠癌患者的治疗中至关重要 ^[15]，相较于 Sanger 测序法，实时荧光PCR 检测 KRAS 基因突变具有显著优势：灵敏度更高，能够精准捕捉低丰度的突变基因；操作流程简便快捷，可缩短检测周期；同时，检测成本更低，减轻患者经济负担。这些优势使其能够更高效地辅助结直肠癌症患者的临床治疗，为个性化精准医疗提供有力支持，有利于提升患者的治疗效果与预后。

本研究针对市场需求，基于多重 PCR、超敏检测特异引物及 TaqMan 荧光探针，构建安全高效的全自动核酸提取及扩增检测模式，本研究中的考核试剂不但可以提升检测效率，而且可以降低检测误差。反应体系中的外源性内参不但可以避免检测结果的假阴性，而且能全程监测样本提取及扩增，具有防污染作用的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，可有效防止实验室扩增产物污染，避免样本假阳性扩增。

本研究对人 KRAS 基因突变检测试剂盒通过性能评价数据统计分析，试剂检测限为 10 ng/反应体系可检出 1% 的 KRAS 突变型、 精密度CV ≤ 15%，准确度检测均为突变阳性，特异度检测中 KRAS 基因突变检测试剂盒涵盖 7 个检测位点间均无交叉反应，同源基因及相关病原体检测均未检出突变型，性能评价指标符合《指导原则》^[14] 的要求。临床对比研究中，考核试剂与对照试剂的阴性符合率、阳性符合率和总符合率均达 100%，且两者具有极高的一致性（Kappa ≥ 0.75）。

综上所述，本研究开发的人 KRAS 基因突变检测试剂盒（PCP- 荧光法）具有较高的准确度和可靠性，与已上市同类产品具有等效性，能够满足临床对 KRAS 基因突变检测的需求。

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