电转染主要通过物理电流击穿细胞膜形成瞬时孔隙，目的基因通过孔隙进入细胞 ^[1]，这种方法具有操作简便、毒性小、电转染效率较高等优点，其转染效率通常在 30% ~ 90% 之间 ^[2-4]。电转染在克隆操作以及表达中具有重要作用，因此，提升基因电转染效率是当前基因工作研究人员关注的重点问题 ^[5]。电转染效率受很多因素的影响，包括电转染缓冲液 ^[6-8]、电转染程序 ^[9-11]、细胞数量 ^[12]、电转染质粒量 ^[13-15]、电转染前后温度 ^[16] 等。不同的细胞系有不同的最佳电转染条件 ^[17]。哺乳动物细胞的电转染通常在磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline，PBS）、PBS+ 蔗糖或培养基中进行 ^[18-19]。本研究分析电转染缓冲液、电转染温度和电转染质粒量 3 个因素对细胞活率及电转染效率的影响，从而确定 HD-BioP3 细胞的最佳电转染条件。

1  材料与仪器

1.1  材料

HD-BioP3 细胞购自 Horizon 公 司；GFP 质粒购自 Lonza 公司；EX-CELL® CD CHO Fusion 培养基、L-Glutamine solution、蔗糖购自默克公司；CD FortiCHOTM 培养基、PBS 购自赛默飞世尔科技公司；0.2% 台盼蓝溶液购自 Countstar 公司。

1.2  仪器

电穿孔系统（ 品 牌：Bio-Rad 伯 乐， 型 号：Gene Pulser Xcell，用于转染每种细胞类型的模块化电穿孔系统）；叠加式恒温振荡器（品牌：精骐，型号：IS-RDS6C，带 CO2）；二氧化碳培养箱（品牌：Heal Force，型号：HF90）；洁净工作台（品牌：苏净安泰，型号：SW-CJ-2FD）；电热恒温水浴锅（品牌：上海一恒，型号：HWS-28）；全自动荧 光 细 胞 分 析 仪（ 品 牌：Countstar， 型 号：RigelS2）；离心机（品牌：Eppendorf，型号：5804R）。

2  实验方法

2.1  HD-BioP3 细胞电转染优化前准备

37 ℃水浴复苏一支 HD-BioP3 细胞，待细胞生长至 1.5×106 ~4.0×106 cells/ml 时，按 0.2×106 cells/ml 接种至生长培养基（含 4 mmol/L L-Glutamine solution 的CD Forti CHOTM 培养基）中；电转染前一天将细胞以 0.5×106 cells/ml 接种至生长培养基中培养（培养条件：转速为 120 rpm，二氧化碳浓度为 5%，温度为 37 ℃，振幅为 26 mm），24 h 后用于电转染优化。

2.2  HD-BioP3 细胞电转染优化

2.2.1  HD-BioP3细胞电转染缓冲液和电转染温度优化

准备 PBS、PBS+5% 蔗糖、EX-CELL® CD CHOFusion 培养基、CD Forti CHOTM 培养基 4 种介质作为电转染缓冲液并分别标记为 Buffer1 ~Buffer4 备用； 取 2.1 中 准 备 的 细 胞， 将 0.2% 台 盼 蓝 溶 液与细胞悬液按照 1‥1 比例混合，采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行计数；根据计数结果取5×106 个细胞，以 220 rcf 速度离心 5 min，弃上清液；取电转染缓冲液 600 μl 重悬细胞，再加入 20 μgGFP 质粒，轻轻吹打混匀细胞和质粒转入电击杯，按上述步骤，Buffer1 ~Buffer4 各做两组，一组于常温条件下进行电击，另一组于 4 ℃条件下放置 5 min 后进行电击。电击参数设置如下，电压为 300 V，电容为 950 μF，脉冲为指数衰减，将电击后的细胞迅速转至含预热后的 5 ml 生长培养基的 T25 方瓶中，温度为 37 ℃，二氧化碳浓度为 5%，湿化过夜培养。

2.2.2  HD-BioP3 细胞电转染质粒量优化

根据 2.2.1 选择合适的电转染缓冲液和电转染温度，在 10 ~ 100 μg 之间设置 10 个梯度的电转染质粒量进行最佳电转染质粒量的优化，电击参数设置如下，电压为 300 V，电容为 950 μF，脉冲为指数衰减，将电击后的细胞迅速转到含预热后的5 ml 生长培养基的 T25 方瓶中，温度为 37 ℃，二氧化碳浓度为 5%，湿化过夜培养。

2.3  分析方法

HD-BioP3 细胞电转染优化 24 h 后，用 0.2% 台盼蓝溶液与细胞悬液按照 1‥1 比例混合，采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行电转染效率检测及计数。

3  结果分析

3.1  HD-BioP3 细胞电转染缓冲液和电转染温度优化结果分析

电 转 染 效 率 检 测 结 果 显 示， 在 常 温 条 件 下Buffer1~Buffer4 的细胞电转染效率依次为 8.4%、18.8%、48.8%、22.4%，在 4 ℃条件下 Buffer1~Buffer4 的细胞电转染效率依次为 20.9%、25.2%、67.3%、15.7%；Buffer1 在常温和 4 ℃条件下的细胞电转染效率相差12.5%，依次类推，Buffer1 ~Buffer4 在常温和 4 ℃条件下的细胞电转染效率相差在 6.4%~18.5% 之间；在同一温度下，4 种电转缓冲液的电转染效率差距较大，在常温条件下，Buffer2 和 Buffer4 的细胞电转染效率相差 3.6%，而 Buffer3 和 Buffer1 的细胞电转染效率相差 40.4%，因此在常温条件下细胞电转染效率相差 3.6%~40.4%，依此类推，在 4 ℃条件下细胞电转染效率相差 4.3%~51.6%（图 1~4）。

HD-BioP3 细胞电转染优化 24 h 后，结果显示，在常温条件下，Buffer1 和 Buffer3 细胞活率均 >80%，Buffer4 细 胞 活 率 <60%（ 图 3）； 在 4 ℃ 条 件 下Buffer3 细胞活率 >80%，Buffer1 和 Buffer4 细胞活率 <60%（图 4）。

注：上图为白光 / 明场通道图像；下图为绿光 /PI 通道图像；顺序从左至右依次为电转缓冲液 Buffer1 ~Buffer4

图1 在常温条件下 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

注：上图为白光 / 明场通道图像；下图为绿光 /PI 通道图像；顺序从左至右依次为电转缓冲液 Buffer1 ~Buffer4

图2 在4 ℃条件下 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

图3 常温条件下 HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1 ~Buffer4中细胞活率和电转染效率

图4 在4 ℃条件下 HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1 ~Buffer4中细胞活率和电转染效率

3.2  HD-BioP3 细胞电转染质粒量测试

根据 3.1 选择细胞转染效率和细胞活率均最高的实验条件，即选择 Buffer3 作为电转染缓冲液在 4 ℃条件下进行电转染质粒量优化，结果显示，随着电转染质粒量的增加，细胞活率呈逐渐下降，10~30 μg 电转染质粒量细胞活率 >70%，40~70 μg 电转染质粒量细胞活率在 60%~65% 之间，80~100 μg 电转染质粒量细胞活率均 < 50%。随着电转染质粒量的增加，电转染效率逐渐升高；电转染质粒量为30 μg 时电转染效率达到平台期，电转染质粒量 >70 μg 时电转染效率出现下降趋势，电转染质粒量不同造成电转染效率最大相差 24.6%（图 5~7）。

注：上图为白光 / 明场通道图像；下图为绿光 / PI 通道图像；顺序从左至右依次为质粒量 10 ~ 50 μg

图5 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

注：上图为白光 / 明场通道图像；下图为绿光 / PI 通道图像；顺序从左至右依次为质粒量 60~100 μg

图6 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

图7 HD-BioP3细胞不同电转染质粒量细胞活率和电转染效率

4  讨论

电转染是一种常用的细胞转染方法 ^[20]，目的基因能否进行表达，取决于表达目的基因能否成功进入细胞 ^[21]；这种电转染方式虽然操作简单，电转染效率高，但不合适的电转染条件容易导致细胞无法形成电穿孔或死亡，造成电转染效率下降 ^[22]。

本研究结果显示，在测试 3 个因素对电转效率的影响实验中，不同电转染缓冲液对电转染效率影响最大相差 51.6%，其次为不同电转染质粒量，电转质粒量对电转染效率影响最大相差 24.6%，电转染温度影响较小，不同电转染温度对电转染效率影响最大相差 18.5%。故在 EX-CELL® CD CHOFusion 作为电转染缓冲液、电转染温度为 4 ℃、电转染质粒量为 30 μg 的条件下，电转染效果最好。

综上所述，优化 HD-BioP3 细胞的电转染条件，可为研究外源基因电转染 HD-BioP3 细胞提供基础数据。

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