尿酸是嘌呤代谢的终产物^[1]，主要由细胞代谢分解的核酸和其他嘌呤类化合物以及食物中的嘌呤经酶的作用分解而来。尿酸水平异常可引起痛风、高血压、冠心病、糖尿病、肾病等 ^[2-3]，近年的研究表明血清中尿酸的浓度还与三酰甘油、肌酐的浓度呈正相关性，与心脏损害有关联。

因此，血清尿酸水平是痛风、心脑血管疾病、肾病、糖尿病、白血病等疾病诊断的重要生化指标^[4]，尿酸的检测和分析对临床诊断了解病情进展有重要参考价值。临床实验室测定血清尿酸的常规方法有酶法、伏安法、磷钨酸还原法、毛细管电泳法、液相色谱法等，这些方法同样也存在测定结果间的准确性和可比性问题，因此，建立可靠的参考方法并提供具有准确量值的标准物质同样在临床上具有十分重要的意义。

本研究主要采用同位素稀释 - 气相色谱质谱（ID-GC/MS）法作为血清尿酸的定量测量方法，参照医疗器械检验的实际需求以及临床上高、低样本的水平，制备了 3 个水平的冰冻人血清中尿酸标准物质，可用于检验机构实验室尿酸检测的准确度验证，有利于提高常规方法标准化进程。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 

仪器：7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪（美国 Agilent 公司），电子天平（德国 Mettler 公司，XPE205 DualRang，d=0.01 mg），Milli-Q A10 超纯水机（美国 Millipore 公司），台式离心机（德国 Eppendorf 公司）。

试剂：尿酸纯度标准物质 GBW09202[ 中国计量科学研究院，标示纯度（99.8±0.3 ）%] ；尿酸浓缩同位素（美国 CIL 公 司， 纯 度 98%， 货 号 PR-21771 ）；GBW09157、GBW09169 冰冻人血清尿酸成分分析标准物质；Mill Q 超纯水系统制备的实验用水；磷酸氢二铵（北京化学试剂研究所 ）； 无 水 吡 啶（ 美 国 Sigma 公 司 ）；衍生 化使 用silyl 991（ 德 国 MACHEREY-NAGEL）； 超滤管（ 美 国Millipore 公司）。

1.2 样品制备

通过混合人血清制备标准物质候选物，在人血清选择上，剔除溶血、脂血、黄疸样本和乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋、梅毒的阳性样本。将筛选后的血清样本分为高、中、低 3 个水平分别混合，经离心、分级过滤后按 1.2 ml/ 支分装于 AXYGEN 无色冻存管，置于 -80 ℃冰箱保存。

1.3 均匀性检验

从批单元（600 支）中选取一个子集，由 25 个单元组成，通过对 25 个单元重复 3 次测量进行均匀性验证。选取子集的方法是按照覆盖整批原则进行随机抽样。分别采用顺、逆和间隔的顺序对每个样品进行 3 次重复测量。

均匀性检验使用常规测量方法 - 酶比色法测量尿酸含量，在重复性条件下进行。酶比色法的原理是反应生成的醌亚胺在 505 nm 波长有最大吸收，所产生的颜色强度与血清中尿酸含量成正比，再通过与同样处理的尿酸标准溶液比较，经过计算可求出血清中尿酸的含量。采用方差分析法对检测结果进行检验，计算统计量 F 值，根据给定的显著性水平查表得到 F 的临界值，若计算得到的 F 小于临界F 值，则认为组内与组间无明显差异，样品均匀。

1.4 稳定性检验

标准物质的长期稳定性与其规定的贮存条件有关，短期稳定性与样品运输、使用过程中的外部因素有关。因此，通过稳定性研究评估稳定性相关测量不确定度以及确定适当的贮存和运输条件。将标准物质按照规定的贮存条件置于 -80 ℃贮存，分别在贮存 0，1，2，3，4，5，6 个月后各取出 2 瓶放入对照温度 -140 ℃。直到 6 个月稳定期满后采用同步稳定性研究法在重复性条件下进行研究。采用经验的线性拟合模型，进行测量数据的趋势分析。用 t 检验检验趋势显著性。

1.5 样品定值

本研究中采用ID-GC/MS 法作为血清尿酸的定量测量方法，基本原理参照国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM） 列 表 中 NRMeth 4（Clin. Chem.,1993,39,993-1000 ）尿酸同位素稀释 - 气相色谱 / 质谱参考方法^[5]。

候选标物溯源至中国计量科学研究院尿酸纯度标准物质 GBW09202，并用中国计量科学研究院的 GBW09157 和GBW09169 冰冻人血清尿酸成分分析标准物质进行方法学验证，作为溯源性的保证措施。

1.5.1 样品配制

用重量法配制尿酸标准溶液和同位素内标溶液，取一定量的尿酸标准溶液和同位素内标溶液分别配制成尿酸工作标准溶液和同位素内标工作溶液。称取一定量的血清样品，精确称重；加入适量的内标液，使得血清中原有的尿酸质量与加入的同位素标记尿酸质量的比值 r 接近 1:0。称取与上一步加入血清样品中同样量的内标溶液两份，分别加入尿酸标准溶液，使得未标记的尿酸和同位素标记的尿酸质量的比值 r 为 0.8~1.0 和 1.0~1.2。所有溶液混匀后置于室温使其充分平衡。

1.5.2 样品处理

将高、 低标及血清样本各取100μl，加入超滤管，13000转 /min 的离心力离心15 min。取下层20μl 超滤液置于70 ℃氮吹吹干后，加入50μl 无水吡啶和50μl silyl 991，于振荡器充分混匀后，70 ℃水浴加热45 min。经0.22 μm 滤膜过滤后，使用 GCMS 分析。

1.5.3 GC/MS 分析条件

进样量 1 μl，分流比 40 ︰ 1，溶剂延迟 2.7 min ；辅助加热器 280 ℃，进样器 270 ℃，氦气流速 1.0 ml/min，柱子HP-5MS，起始温度 230 ℃，保持 1 min，以 15 ℃ /min 的速度升温至 280 ℃，后设置为 290 ℃运行 5 min。离子源温度230 ℃，四级杆温度 150 ℃，电离能量 70 eV ；进样前后用丙酮各洗 3 次；选择性离子检测：m/z 456（unlabled）和m/z 458（labled）。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验

3 个水平候选标物的均匀性测试结果见表 1~3。使用 F 检验对 3 个水平候选标物的均匀性检验结果进行分析。计算 F 值，与临界 F 值 1.74 比较，均小于临界值，说明 3 个水平候选标物的均匀性良好。



2.2 稳定性检验

3 个水平候选标物的 6 个月稳定性测试结果见表 4~6。采用经验的线性拟合模型，进行测量数据的趋势分析。用 t 检验进行趋势显著性检验（95% 置信区间），计算得出 t 值小于临界值 2.57，说明候选标物在 6 个月内的稳定性良好。


2.3 样品定值

2.3.1 方法精密度考察

取 3 种不同浓度尿酸血清，对每种重复测定 3 份，考察方法的精密度，结果见表 7。结果表明，方法精密度符合要求。每个样品重复进样3 次，以所得数据的均值作为一个测定结果。

2.3.2 方法准确度考察

用本法测定中国计量科学研究院的 GBW09157、GBW09169 冷冻人血清尿酸标准物质，进行 3 次独立分析，测定结果见表 8。

测值都在标准值不确定度范围内，说明本方法有较好的准确度。

2.3.3 定值结果

本研究中候选血清尿酸标准物质浓度由北京市医疗器械检验所定值。采用 ID-GC/MS 测量血清尿酸浓度时，随机抽取本研究研制的人血清标准物质共 6 支，对每支血清测定 3 份，每份测 6 遍，取均值。第 1 天测定 3 支，隔日再测定 3 支。浓缩同位素与标准溶液混合样和浓缩同位素与血清样品混合样交替测定，两天检测结果的变异系数应该小于1.5%。以 6 支血清测量值的平均值作为该标准物质的标准值。见表 9~11。



2.3.4 密度测定

20 ℃时，用25 ml 容量瓶，XPE205 DualRange（d=0.01 mg，最大称量210 g，Mettler 公司）测量水平1血清的密度6次，得到其密度值为 1.021 g/ml ；测量水平 2 血清的密度 6 次，得到其密度值为 1.047 g/ml ；测量水平 2 血清的密度 6 次，得到其密度值为 1.028 g/ml，见表 12。


2.3.5 不确定度评定

2.3.5.1　尿酸浓度不确定度相关的不确定度

分析不确定度来源，血清中尿酸的浓度由下式计算得出：

其中涉及的参量如下：Csam 为血清样品中尿酸的浓度（μmol/L）；mlab(sam) 为血清样品中加入内标的质量（mg）；mIS(sam) 为血清样品中加入所配制的内标溶液的质量（mg）；P 为尿酸标准物质（GBW09202 ） 的 纯 度；msam 为 血 清 样 品 的 质 量（mg）；Dsam 为血清样品的密度（g/ml）；M 为尿酸的摩尔质量（g/mol）。

2.3.5.2　瓶间不均匀性相关的相对不确定度（ubb,rel）

由均匀性检测结果得出由均匀性差异引入的不确定度。2.3.5.3　长期稳定性相关的相对不确定度（ults,rel）由稳定性检测结果估算出 6 个月的稳定性差异引入的不确定度。

2.3.5.4　合成不确定度

uc,rel= u2cher,rel+u2bb,rel+u2lts,rel

2.3.5.5　扩展不确定度

在 95% 的置信水平时，通常取包含因子 k=2，得到 3个水平候选标物的扩展不确定度分别为5.8 μmol/L，9.2 μmol/L和 21.1 μmol/L。

2.4 研制结果

本研究研制的冰冻人血清中尿酸浓度标准物质的浓度值及其不确定度见表 13。


3 结论

标准物质的基质是混合人血清，在 -80 ℃条件下贮存，使用前应在室温下复融。复融后 3 个水平的尿酸浓度及不确定度分别为（223.6±5.8 ）μmol/L，（419.8±9.2 ）μmol/L，（753.8±21.1 ）μmol/L（k=2 ）。均匀性检验和稳定性检验结果表明，本标准物质均匀性良好，在 -80 ℃下保存 6 个月稳定性良好。

预期用于体外诊断领域校准测量系统、测定试剂盒准确度评价、常规测量方法产品校准品的量值传递、实验室进行血清中尿酸检测的质量控制以及能力验证等，有利于实现血清中尿酸体外诊断测量的标准化以及测量结果的可比性。

［参考文献］

［1］张传宝，张江涛，张天娇，等 . 同位素稀释液相色谱串联质谱法测定人血清尿酸 [J]. 检验医学，2009，24（12）：878-882.

［2］邵丽丽，潘瑾，苏毅 . 重庆地区城市健康成人血清尿酸浓度的调查 [J]. 临床检验杂质，2001，19（1）：51-52.

［3］杨梦瑞，戴新华，杨屹，等 . 冰冻人血清尿酸标准物质的研制[J]. 计量学报，2010，31（1）：86-90.

［4］范健睿，夏昕晖 . 尿酸结石临床危险因素的研究现状 [J]. 医学临床研究，2015，32（1）：185-187.

［5］Stöckl D, Reinauer H. Candidate reference methods for determining target values for cholesterol, creatinine, uric acid, and glucose in external quality assessment and internal accuracy control. I. method setup[J]. Clin Chem, 1993, 39(6): 993-1000.