前哨淋巴结是肿瘤淋巴引流通路上的第一个淋巴结,在乳腺癌手术中,已被广泛应用于预测腋窝淋巴结的状态^[1-4]｡一张高质量的冷冻切片对于确保术中冷冻病理诊断的科学性､准确性具有极其重要的作用,而前哨淋巴结为细胞丰富的组织,质地较脆,用常规冷冻方法较难获取理想的切片｡ 我们结合多年的工作经验对前哨淋巴结的冷冻切片制作方法进行总结｡

1  材料

临床科室送检的新鲜前哨淋巴结组织,德国LEICA CM1900型恒温冷冻机,OCT包埋剂,其他试剂均按病理常 规工作配置｡

2  方法

2.1  制片准备

为了确保工作时段冷冻切片机能够正常有效运转,日常的维护保养工作必不可少,如及时补充制冷剂､确保刀片锐利等｡此外冷冻机通常是24处于待机状态,避免经常开､ 关机器损害压缩机,提前1h开机预制冷^[5]｡软毛刷､洁净的玻片､最佳切割温度 (OCT)包埋剂､固定剂､染色剂等材料与试剂也是需要提前检查､备好,避免制片时的缺失｡

2.2  取材

前哨淋巴结组织必须新鲜,不能浸泡0.9%氯化钠注射液和固定剂｡尽可能不用自来水清洗,水洗可导致组织含水量增加,易形成冰晶,不仅伤刀,而且会导致细胞肿胀变形, 进而影响染色及诊断^[6]｡此外取材时需要对前哨淋巴结内的脂肪采用解剖刀进行刮除,位于被膜线附近的脂肪采用刀切除,以期取得较好的制片效果,但若一味地将脂肪组织剔除将降低冷冻病理检查的敏感度,增加假阴性,影响病理诊断的准确性^[7],因此取材时要求尽量剔除脂肪组织,取材大小厚薄应适中｡对于实际操作中无法剔除的脂肪组织,切片由于不同组织的制片条件完全不同,切片时可以看到脂肪部分显示为破碎､空洞,导致不能切出完整的片子,此时只需注意将前哨淋巴结分次切出切完整即可,脂肪组织可忽略｡

2.3  包埋

先倒少许OCT包埋剂于金属标本托上,随即将组织置于 其上,并加用OCT包埋剂包埋组织｡此种包埋方法可使组织得以较好地定位,同时后添加的OCT包埋剂起到牵拉展开组织､防止切片皱褶产生的目的｡另外OCT包埋剂包埋过程中应尽量避免小气泡的产生,以免影响旁边组织挤压皱褶｡

2.4  切片

前哨淋巴结组织为细胞丰富的组织 , 质地较脆 , 外覆包膜,切片时首先注意控制箱体温度 , 其冷冻温度较其他组织温度高 , 经过我们多次试验尝试得出其冷冻温度18~20℃较好｡如果冷冻时间过长或冷冻温度过低则切片时呈碎屑状, 易出现皱褶､裂纹 (图 1A) , 补救方法是用戴手套的手指或手掌轻贴组织数秒 , 使其稍回温 , 细修几片后再匀速切片, 依然可以切出较为满意的切片  (图1B)｡其次注意调节切片厚度,切片过厚会导致淋巴细胞致密重叠而难以观察细胞形态,同样经过我们多次试验尝试得出切片厚度在4μm为最佳｡粗修切面至完整后匀速缓慢切片,具体切片操作时进刀要快,用力均匀｡选择合适组织切片,用软毛刷按压切片前缘,防止切片卷曲､粘连､脱片等｡

2.5  固定与染色

贴片后立即将切片浸入固定液中固定2~3min｡已固定的切片用自来水充分浸洗 1~2min,放入新鲜配制苏木精染液中进行染色｡此时注意因前哨淋巴结为细胞核密集组织, 在苏木精染色时间上应缩短｡一般组织在苏木精的染色时间上为2~3min,而前哨淋巴结组织只能 1~2min后水洗盐酸分化返蓝,再放入伊红染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明后中性树脂封片｡如果染色时间过长在高倍镜下细胞核呈深蓝色,染色质结构不清 (图 1C);但过分缩短苏木精染色时间则导致细胞核浅染,整张切片颜色灰暗｡因此在经过多次试验后苏木精染色时间 1~2min为最佳 (图 1D)｡

                                 
                    注:A.冷冻时间过长;B.冷冻时间适宜;C.染色时间过长;D.染色时间适宜

图 1 前哨淋巴结组织冷冻切片不同条件下的效果

3  小结

前哨淋巴结组织冷冻切片制作由于其特有的特点,在日常冷冻切片工作中较难获取高质量的片子^[8-9],我们浅析本科室多年对前哨淋巴结组织冷冻切片制作各环节的改进而制作的快速冷冻切片,能够最大程度获得组织结构完整,胞核胞浆等染色清晰､对比度良好,同时切片平整､无皱褶､裂纹等,能较好地满足冷冻病理诊断的要求｡冷冻制片技术是病理科最重要的常规工作之一^[10]｡制作一张完整､优质的高质量快速冷冻切片不仅需要高度的责任心,更要掌握关键性技术操作要领,以及丰富的工作经验｡只有在每一个环节中都做到精益求精,才能获得最佳的冷冻切片｡

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