灭菌是保障医疗器械产品安全性与有效性的关键环节，环氧乙烷（ethylene oxide，EO）灭菌因具备广谱杀菌、穿透力强、对器械损伤小、适用范围广等优势，成为医疗器械领域常用的灭菌技术 ^[1-2]。EO 本身具有强毒性与致癌性，可引发呼吸道刺激、中枢神经系统损伤、皮肤及眼黏膜灼伤，同时存在生殖毒性与细胞遗传毒性 ^[1，3]。因此，灭菌后医疗器械的 EO 残留检测对保障临床应用安全至关重要。

目前，气相色谱法是 EO 残留检测的主流技术 ^[4-9]。医疗器械领域的 EO 残留检测主要遵循 GB/T 14233.1—2022《医用输液、输血、注射器具检验方法 第 1 部分：化学分析方法》^[4] 与 GB/T16886.7—2015《医疗器械生物学评价 第 7 部分：环氧乙烷灭菌残留量》^[10]。其中，GB/T 16886.7 —2015^[10] 仅概述了气相色谱法检测 EO 残留的条件选择与优化方向，未明确具体取样方法、检测操作及接受标准等细节。GB/T 14233.1 — 2022^[4] 对医用输液、输血、注射器具的样品浸提方法作了规定，列举了极限浸提法的试验步骤，针对性较强，但未明确具体方法的接受标准。此外，由于医疗器械种类繁杂、材质与结构差异显著，GB/T14233.1 — 2022^[4] 针对医用输液、输血、注射器具的 E0 含量极限浸提检测方法是否适用于动物源性医疗器械，以及此类特殊器械的取样方法，尚缺乏明确依据。

本研究的检测对象为异种生物材料植入式脑神经外科医疗器械，该产品以牛跟腱为原料并经特殊工艺制备而成，富含胶原蛋白大分子，其技术源自国外转移，国内尚无同类的医疗器械，目前处于注册阶段，尚未上市。现有法规与文献中尚无针对牛跟腱来源植入式脑神经外科医疗器械的专属EO 残留检测方法与研究。本研究曾委托外部灭菌供应商开展 EO 残留预测试，结果显示按照 GB/T14233.1—2022^[4]以水为溶剂进行长时间极限浸提、直接进样的测试方法开发失败。基于此，本研究旨在探究 GB/T 14233.1—2022 对于该类异种生物材料医疗器械 EO 残留热极限浸提顶空 - 气相色谱法检测的适用性，明确最优取样方法及标准品有效使用期限，并从样品制备、检测方法、数据分析及结果验证等方面展开详细阐述。

1 实验仪器与方法

1.1 仪器与材料

实验仪器如下：（1）Agilent 8890 气相色谱仪（美国安捷伦公司，型号：8890），配有氢火焰离子化检测器和 7697A 自动顶空进样器。（2）移液器（德国 Eppendorf 公司，规格：100~1 000 μl、0.5~5.0 ml、1~10 ml）。（3）电子天平（德国赛多利斯公司，型号：MCA2225S，BCE224-1CCN）。所有仪器的校验、验证和确认工作已经完成且通过。

实验材料如下：（1）牛跟腱植入式脑神经外科医疗器械产品（暂无法提供产品相关信息）。（2）EO 标准品溶液（中国食品药品检定研究院；规格：1 ml/ 瓶，9.3 mg/ml；编号：350007；批号：350007-202405）。（3）超纯水（埃英水处理有限公司）。

1.2 标准溶液的配置

精密吸取 0.108 ml E0，置于 100 ml 容量瓶中，用超纯水稀释至 100 ml，摇匀，即得浓度为 10.0 μg/ml（相当于每 100 ml 溶液中含 1.0 mg 的 E0）的 E0 储备溶液，避光密封备用。

分别精密吸取 EO 储备溶液 0.5、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ml 于 50 ml 容量瓶中，加超纯水至 50 ml，摇匀，可得浓度为 0.1、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml 的EO 标准溶液。其中，浓度为 2.0 μg/ml 的溶液为对照溶液。

1.3 样品浸提液的配制

牛跟腱植入式脑神经外科成品共 7 种规格，不同规格产品的成分一致，仅尺寸存在差异。因此，任意规格产品均可作为代表性样品用于本实验。本研究选取国外订单量相对较大的尺寸（3 英寸 ×3 英寸）产品 X7 为研究对象，考察不同取样重量对于检测的适用性：分别精密称取 X7 产品 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，剪碎，逐一置于 20 ml 顶空瓶中。根据 GB/T 14233.1 — 2022^[4] 中的热极限浸提顶空 -气相色谱法，需要添加 5 ml 超纯水。由图 1 可知，5 ml 超纯水无法完全浸没 0.1 g 的样品。

图 1 顶空瓶中不同重量样品 a 正面 （从左到右为 0.1~1.0 g）；b 反面 （从左到右为 1.0~0.1 g）

结合产品 EO 残留接受标准（10 μg/cm2 ）^[10]，对取样方式进行改进：将未经过 EO 灭菌的产品加工为 2.5 cm×2.0 cm 的标准方片，每片含正反两面，总表面积为 10 cm2 （约 0.021 g）。取该标准方片样品置于 20 ml 顶空瓶中，精密加入 5 ml 超纯水（对照溶液）或 5 ml 相应浓度的 EO 标准溶液（EO 加标组溶液），立即压盖密封，摇匀后置于顶空进样器中，在（60±1）℃条件下平衡 40 min，进行后续检测。

1.4 气相色谱条件

顶空平衡温度为 60 ℃，平衡时间为 40 min^[4]，柱温为 50 ℃，保持 8 min，进样口温度为 200 ℃，检测器温度为 250 ℃。载气为氮气，载气流速为1.5 ml/min，分流比为 20‥1，分流流量为 30 ml/min。

1.5 检测指标

1.5.1 标准曲线的性能指标验证

按 1.3 制备一式 3 份不同浓度的 EO 标准溶液，存储于 2 ~ 8 ℃冰箱中，并于第 1、4、8 天检测 EO 残留量，得到标准曲线，分析其精密度、残余标准偏差的相对偏差（relative standard deviation,RSD）、拖尾因子。

1.5.2 方法的性能指标验证

（1）专属性。专属性指其他成分（如杂质等）可能存在的情况下，方法能正确检测出被测物的能力。使用气相色谱对 5 ml 空白对照溶液（超纯水 + 产品）、5 ml EO 对照溶液（浓度为 2.0 μg/ml 的EO 标准溶液，不加产品）、5 ml EO 加标组溶液（超纯水 + 产品 +2.0 μg/ml EO 标准溶液）进行检测，验证检测方法的专属性。

（2）精密度和准确度 ^[11]。精密度是考察相同操作人员、相同测试条件、相同测试设备，不同浓度多次测量的重复性。准确度也可称为回收率，是评价所建立方法的检测结果与真实值或参比值接近的程度，需要计算检测结果与参比值的百分比 ^[11]。分别精密量取 EO 储备溶液 16、20、24 ml 于100 ml 容量瓶中，加水至 100 ml，摇匀，定容，得浓度为 1.6、2.0、2.4 μg/ml 的 EO 标准溶液，每个浓度制备 3 组（组 1、2、3）。将 9 个 2.5 cm×2.0 cm、总表面积为 10 cm2 的牛跟腱植入式脑神经外科医疗器械产品分别加入 20 ml 顶空瓶中，并精密加入各个浓度的 5 ml EO 溶液，制备成 EO加标供试品溶液，立刻压盖，摇匀，经平衡后检测。根据标准曲线回归方程和仪器测得的峰面积，可计算 EO 加标溶液浓度，将计算得出的理论值和已知的实际浓度值相比，即可得出回收率。

（3）中间精密度。该方法用于评估 2 个分析员在不同日期对相同浓度多次检测（不同人员）和1 个分析员在不同日期对相同浓度多次检测（不同日期）的可重复性。每天配制 2.0 μg/ml 的 EO 加标供试品溶液 1 组（2.0 μg/ml EO 标准溶液 +2.5 cm×2.0 cm 未经灭菌产品），重复检测 3 次。

（4） 线性。配制 0.1、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml 各个浓度的 EO 标准溶液各 3 组，制备标准曲线。

（5）检测限（limit of detection, LOD）。根据《中国药典》^[11] 中的计算方法计算理论 LOD 值，再配制和 LOD 浓度一致的 EO 标准溶液进行检测，验证理论 LOD 值确实可以被检测出，从而确定 LOD 值，具体方法如下：LOD=3.3× 标准曲线截距的标准偏差 / 标准曲线的平均斜率。配制 6 个 LOD 浓度的EO 标准溶液及 6 个空白的超纯水溶液。验证 LOD的平均峰面积不小于 3.3 倍空白溶液平均峰面积，以确定通过计算得出的 LOD 值能成功检测出实际配制的 LOD 浓度 EO 标准溶液。

（6）定量限（limit of quantitation, LOQ）。分别精密量取 EO 储备液 1、2、4、6、8、10 ml 至 100 ml 容量瓶中，加超纯水至 100 ml，摇匀，定容，得到浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/ml 的 EO 溶液，吸取 5 ml 至顶空瓶中，封盖，摇匀，每个浓度测试 6 次。同时用超纯水制备空白溶液，吸取 5 ml 至顶空瓶中，封盖，摇匀，测试 6 次。满足平均峰面积≥空白溶液 10 倍的浓度即为 LOQ。

（7）范围。范围是指方法能够达到规定的精密度、准确度和适用要求时，所对应的被测定样品中待测成分的含量（或浓度、或响应值）的区间范围。

2 结果

2.1 标准曲线性能指标验证结果

2.1.1 标准曲线精密度

标准曲线的各个浓度点在不同日期测试的 RSD均≤ 6%，符合《中国药典》^[11] 关于分析方法精密度的要求，见表 1。

表 1 标准曲线的精密度

注：RSD 为相对偏差。

2.1.2 标准曲线残余标准偏差的 RSD

标准曲线残余标准偏差的 RSD 均≤ 5%，拟合曲线的可靠性较好，满足 GB/T 16886.7—2015^[10] 关于标准曲线 RSD 的要求，见表 2。

表 2 标准曲线残余标准偏差的 RSD

注：RSD 为相对偏差。

2.1.3 标准曲线拖尾因子

所有 EO 标准溶液在不同浓度、不同日期的拖尾因子 ^[10] 平均值均≤ 1.8，符合 GB/T 16886.7—2015^[10] 色谱仪拖尾因子的要求，见表 3。

表 3 标准曲线的拖尾因子

以上结果表明，标准溶液在第 1、4、8 天的标准曲线精密度、残余标准偏差的 RSD、拖尾因子及相关系数 R² 均≥ 0.99，均满足要求。配制的 EO标准溶液在 8 d 内未见明显异常均可使用，但考虑使用风险与企业实际成本，最终将 EO 标准溶液的使用期限规定为配制后 7 d。

2.2 方法的性能指标验证

2.2.1 专属性

空白对照组未检测出 EO 溶液，见图 2。EO的保留时间均为 6.59 min，峰形尖锐，分离效果良好，说明该方法专属性较好，EO 峰未被干扰，见图 3 和图 4。

图 2 空白对照组溶液的气相色谱图

图 3 对照品溶液（EO 浓度为 2.0 μg/ml）的气相色谱图

图 4 EO 加标组溶液（EO 浓度为 2.0 μg/ml）的气相色谱图

2.2.2 精密度和准确度

使用气相色谱仪对配制的 1.6、2.0、2.4 μg/ml浓度 EO 标准溶液进行检测，得到的标准曲线为Y=0.6529X+0.0478，相关系数 R² 为 0.9998，所有 EO标准溶液的拖尾因子均≤ 1.8。不同浓度、相同检测员多次测量的 RSD 均≤ 6%，重复性较好。所有浓度不同组别的回收率和每个浓度的平均回收率均在80%~115% 之间，准确度较高，符合《中国药典》^[11]关于分析方法精密度和准确度的要求，见表 4。

表 4 精密度和准确度

注：EO 为环氧乙烷，RSD 为相对偏差。

2.2.3 中间精密度

每次检测前，使用气相色谱仪对配制的 0.1、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml 浓度 EO 标准溶液进行检测，不同人员、不同日期和相同人员、不同日期对相同 EO 浓度 2.0 μg/ml 检测结果的相对标准差均≤ 6%，符合《中国药典》^[11] 关于分析方法精密度要求，见表 5 和表 6。

表 5 中间精密度 （不同人员）

注：EO 为环氧乙烷，RSD 为相对偏差。

表 6 中间精密度 （不同日期）

注：EO 为环氧乙烷，RSD 为相对偏差。

2.2.4 线性

配制 0.1、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml 各个浓度的 EO 标准溶液各 3 组，制备标准曲线。EO浓度 0.1 ~ 4.0 μg/ml 范围内，R² 均≥ 0.99，呈良好线性关系，见表 7。

表 7 线性实验结果

注：实验 1、2、3 的回归方程分别为 Y = 0.6510X- 0.0504、Y = 0.6180X+ 0.0924、Y = 0.6325X+ 0.1129， 平均回归方程为Y = 0.6338X+ 0.0516。

2.2.5 LOD

由表 7 可知截距为 +0.0516，计算出标准曲线截距的标准偏差 0.0890，标准曲线的平均斜率为0.6338，LOD'=3.3×0890/0.6338=0.4634 μg，0.4634 μg对应的是 5 ml 溶液的检测限，LOD=0.4634 μg/5 ml=0.0927 μg/ml。LOD 平均峰面积 > 3.3 倍空白平均峰面积，该方法的最低 LOD 为 0.092 7 μg/ml，见表 8。

表 8 LOD 验证结果

注：LOD 为检测限。

2.2.6 LOQ

浓度为 0.1 μg/ml 的 EO 溶液已经满足 EO 溶液平均峰面积 > 10 倍空白平均峰面积，相对标准偏差为 5.41%，符合≤ 6% 的要求 ^[11]，见表 9。

表 9 LOQ 验证结果

注：LOQ 为定量限，EO 为环氧乙烷。

2.2.7 范围

该方法的测试范围为 0.1 ~ 4.0 μg/ml，此范围内标准曲线拟合性较好、准确度高、可重复性强，说明方法可靠。

3 讨论

国内首次引进的牛跟腱来源植入式脑神经外科器械缺乏专属的 EO 残留检测方法，GB/T 14233.1—2022^[4] 等现行标准的适用性、取样方法、接受标准及标准品使用期限均不明确。本研究委托外部灭菌供应商开展 EO 残留预测试，供应商参照 GB/T14233.1—2022，采用超纯水为溶剂进行 24 h 极限浸提，结合气相色谱直接进样技术进行检测。如图 5 所示，直接进样法检测的 EO 峰保留时间为0.601 min，其附近存在较多与 EO 峰有部分重叠的干扰峰。这种异常可能是由于此类动物源性生物材料富含胶原蛋白，经 24 h 浸提后大量蛋白大分子析出，直接进样时造成色谱柱污染，最终导致检测失败。由此可见，GB/T 14233.1—2022 规定的检测方法无法通用于所有类型的医疗器械，需结合产品的材质与结构特性，针对性优化检测方案。

图 5 直接进样法检测图谱

本研究的核心挑战在于目标产品的特殊性——牛跟腱来源的异种生物材料富含胶原蛋白大分子，且具有疏松多孔的结构特性，与 GB/T 14233.1—2022 适用的医用输液、输血、注射器具存在显著差异。据此，本研究针对性优化检测技术，采用热极限浸提顶空进样模式，通过分析浸提液上方的气体平衡相实现检测，从根源上规避产品中蛋白大分子对色谱柱的污染风险，同时证实 GB/T 14233.1—2022 规定的热极限浸提原理仍适用，但需优化进样方式方可适配。本研究不仅攻克了特殊材料的检测难题，还为同类产品的 EO 残留检测提供了技术参考。

取样方法的合理性直接决定检测结果的代表性与准确性。现有标准未明确特殊生物材料器械的适宜取样方法，传统“称取 1 g 样品”的方案因产品疏松多孔导致浸提液无法完全浸没，难以适用。本研究创新地提出“面积取样法”，契合产品“残留量 - 表面积”的计量逻辑，既保障了 EO 充分溶出，又简化了操作、提升了重复性，可为多孔生物材料器械取样标准化提供参考。

EO 标准溶液的稳定性直接影响检测结果的准确性，但现有研究对其储存时效的考察较少。本研究系统考察了 EO 标准曲线的时效性，同时基于数学残差原理优化残余标准偏差的 RSD 的计算方法，简化了运算流程，并首次通过多时间点系统验证标准曲线拟合度，为 EO 标准溶液的时效判定提供了更充分的实验依据，弥补了现有研究的不足。

LOD 与 LOQ 计算准确性直接影响方法的适用性判定。本研究计算检测限时，因未将 5 ml 浸提液中 EO 总含量换算为 1 ml 含量，曾出现“检测限大于定量限”的不合理困局，经换算修正后获得合理结果，确保了 LOD 和 LOQ 的准确性。

综上所述，本研究经多维度验证，证实了热极限浸提顶空 - 气相色谱法具有良好的可靠性与重复性。该方法不仅可精准适用于牛跟腱来源植入式脑神经外科器械的 EO 残留检测，还为其他异种生物材料、多孔结构医疗器械的 EO 残留检测提供了技术参考，丰富了特殊材料器械 EO 残留检测的方法体系。本研究的不足之处在于，当长时间极限浸提的直接进样法失败时，受时间与成本限制， 未开展气相色谱 - 质谱法 ^[12-13]（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）检测探索，后续研究可针对 GC-MS 能否有效分离 EO 与蛋白成分做进一步研究。

【参考文献】 

［1］刘柏东，贺伟罡，陈敏 . 医疗器械中环氧乙烷灭菌残留物的来源分析 [J]. 中国医疗器械杂志，2020，44（5）：443-447.

［2］SHINTANIH. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices[J]. BiocontrolSci, 2017, 22(1): 1-16.

［3］姚天平，钱心依 . YY 0336—2020《一次性使用无菌阴道扩张器》标准解析 [J]. 医疗卫生装备，2022，43（1）：85-88.

［4］国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会 . 医用输液、输血、注射器具检验方法 第 1 部分：化学分析方法：GB/T 14233.1— 2022 [S]. 北京：中国标准出版社，2022.

［5］刘若锦，王子梦，李辉 . 基于多组件医疗器械产品的环氧乙烷残留量检测方法研究 [J]. 医疗卫生装备，2024，45（1）：56-61.

［6］吕亚宁，张逸君，胡亚蓉，等 . 顶空 - 气相色谱法测定芝麻和茶叶中环氧乙烷的残留量 [J]. 粮油食品科技，2023，31（2）：154-162.

［7］周云婷，杨慧萍，钱菁，等 . 顶空气相色谱法测定明胶空心胶囊中 EO 和 ECH 的残留量 [J]. 化工管理，2022（13）： 47-50.

［8］王澍，江小明，何东平，等 . 食品中环氧乙烷及其代谢物 2- 氯乙醇的测定 [J]. 粮食与油脂，2023，36（9）：145-149.

［9］刘春燕，周晓琳 . 一次性医疗用品环氧乙烷残留量检测顶空气相色谱法的应用分析 [J]. 中国保健营养，2016，26（6）：311-312.

［10］国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会 . 医疗器械生物学评价 第 7 部分：环氧乙烷灭菌残留量：GB/T 16886.7—2015[S]. 北京：中国标准出版社，2015.

［11］国家药典委员会 . 中国药典 [S]. 北京：中国医药科技出版社，2020.

［12］OBA T, TSMJI K, MIZΜMACHI S, et al. Studies on residual ethylene oxide in medical devices (I)-Gas chromatographic de-termination of ethylene oxide in plastics[J]. Ikakikaigaku, 52(3): 134-139, 1982.

［13］李应培， 邓琪锦， 区丽华，等 . HS-GC-MS 测定无纺布中的环氧乙烷残留量 [J]. 中国纤检，2022（10）：60-62.

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