新型冠状病毒核酸检测技术是一种先进的生物医学检测方法，主要采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术。该检测方法针对咽拭子、鼻拭子、痰液等样本进行 RNA 提取，随后通过逆转录将目标 RNA 转化为 DNA，并对其进行扩增。当检测结果达到一定阈值时，即可判定为阳性 ^[1]。在挑选冠状病毒核酸检测试剂盒时，需要综合考虑多个因素，包括样本类型及其数量、纯化效果、可重复性、安全性、提取方法与技术、核酸质量及稳定性等 ^[2]。性能良好的试剂盒，应该具备特异度高、灵敏度高、稳定性好、操作便捷等特点。高特异度的试剂盒可以准确识别新型冠状病毒与其他病原微生物，避免产生假阳性结果。而高灵敏度的试剂盒，能够快速检测病毒，适用于早期诊断 ^[3]。评估试剂盒的检出能力，分析不同试剂盒检查结果的一致性，有助于判断其性能，提高新型冠状病毒核酸检测结果的准确性，为疫情防控提供保障 ^[4]。本研究采用 5 种不同国产新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行核酸检测，旨在比较不同试剂盒的一致性和检出能力，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取 2021 年 3 月至 2022 年 4 月接受核酸检测的 56 例疑似新型冠状病毒肺炎患者的咽拭子、鼻拭子、痰液等样本。其中，男 29 例，女 27 例；年龄 22 ~ 78 岁，平均（44.81±5.63）岁。

1.2  方法

（1）采集样本：将咽拭子棒置入患者的口腔，在其两侧扁桃体和咽后壁处来回擦拭 3 次以上，将咽拭子放入采样管中保存。（2）实验室检测：每份样本同时采用 5 种新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（编号分别为 A、B、C、D、E）和全自动核酸提取纯化及实时荧光 PCR 分析系统（上海之江生物科技股份有限公司，型号：AutraMic mini4800Plus）进行平行检测（按照试剂盒说明书进行检测）。提取样本中的 RNA，进行逆转录酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），将其转化为 DNA，并对目标序列（目标基因为新冠病毒的 N 基因、ORF1ab 基因）进行扩增。试剂盒 A 扩增反应条件：50 ℃ 10 min，95℃ 10 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，45 个循环，检出 限 为 1 000 copies/ml。试剂盒 B 扩增反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，10 个循环，检出限为 1 000 copies/ml。试剂盒 C 扩增反应条件：50 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃35 s，10 个循环，检出限为 200 copies/ml。试剂盒D 扩增反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃5 s，60 ℃ 45 s，15 个循环，检出限为 1 000 copies/ml。试剂盒 E 扩增反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃5 s，60 ℃ 45 s，10个循环，检出限为100 copies/ml。（3）标本浓度稀释：取 1 份阳性标本，用试剂盒进行检测，然后用无 RNA 酶水进行梯度稀释，获得浓度 1 标本；再应用无 RNA 酶水，进行梯度稀释（2、16 倍），获得浓度 2、3 样本。5 种试剂盒均遵循以上操作步骤，各获得 3 个浓度标本。

1.3  观察指标

（1）5 种试剂盒的检查结果一致性：根据临床确诊情况，计算阳性符合率、阴性符合率，评估其一致性。（2）5 种试剂盒的单个目标基因（N 基因和 ORF1ab 基因）批内重复性：批内变异系数（coefficient of variation，CV）越小表明试剂盒重复性越好，CV= 5 次测量结果的平均值 / 5 次测量结果的标准差。（3）5 种试剂盒不同浓度条件下的N 基因、ORF1ab 基因阳性检出率。

2  结果

2.1  5 种试剂盒检查结果一致性比较

56 例疑似新型冠状病毒肺炎患者经临床诊断确诊阳性 29 例，试剂盒 A、B、C、D、E 的阳性符合率均为 100%（29/29），阴性符合率均为 100%（27/27），检查结果一致性较好。

2.2  5 种试剂盒的单个目标基因（N 基因和 ORF1ab 基因）批内重复性检测

在浓度 1 条件下的 N 基因检测，试剂盒 C 的批内重复性最好，而试剂盒 E 的批内 CV 最大。在浓度 1 条件下的 ORF1ab 基因检测，试剂盒 A 的批内重复性最好，而试剂盒 C 的批内 CV 最大。在浓度 2 条件下的 N 基因检测，试剂盒 C 的批内重复性最好，而试剂盒 B 的批内 CV 最大。在浓度 2 条件下的 ORF1ab 基因检测，试剂盒 A 的批内重复性最好，而试剂盒 E 的批内 CV 最大。在浓度 3 条件下的 N 基因检测，试剂盒 E 的批内重复性最好，而试剂盒 A 的批内 CV 最大。在浓度 3 条件下的ORF1ab 基因检测，试剂盒 B 的批内重复性最好，而试剂盒 D 的批内 CV 最大。见表 1。

表 1 5 种试剂盒的 N 基因和 ORF1ab 基因批内重复性检测结果

注：1 copies/ml 表示每毫升样本中含有 1 个病毒 RNA 分子；CV 为变异系数

2.3  5 种试剂盒在不同浓度条件下的 N 基因、ORF1ab 基因阳性检出率比较

浓度 1、2 条件下，5 种试剂盒的 N 基因和ORF1ab 基因阳性检出率一致；在浓度 3 条件下，试剂盒 E 的 N 基因阳性检出率最高，试剂盒 B 最低；试剂盒 D 的 ORF1ab 基因阳性检出率最高，试剂盒 B 最低。见表 2。

表 2 5 种试剂盒在不同浓度条件下的 N 基因、ORF1ab 基因阳性检出率比较

3  讨论

核酸检测被广泛认为是筛查新型冠状病毒感染的重要方式。在选择新型冠状病毒核酸检测试剂盒时，临床医师会综合考虑多个因素，包括试剂盒的准确度、特异度、灵敏度、适用性和经济性等。通过分析检测原理、目标基因、检出限、核酸提取试剂、反应体系模板和循环次数等基本特征，可以对试剂盒的质量和性能进行全面评价 ^[6]。试剂盒应具备识别新型冠状病毒的能力，从而高效、稳定且准确地检测出该病毒，降低误检和漏检的风险 ^[7]。重复性是评估体外诊断试剂产品性能的重要指标，体现了试剂在不同条件下的稳定性，反映了在相同条件下进行多次测量所产生的变异程度。不同试剂盒的高度一致性，可使不同操作人员在检测同一类型病毒时获得一致的检测结果 ^[8]。因此，选择一致性高、检出能力强、特异度好的试剂盒对于提高新型冠状病毒核酸检测的准确性具有积极的意义，能够为疫情防控提供可靠的参考依据。

新型冠状病毒核酸检测试剂盒通常需要通过同时检测 N 基因和 ORF1ab 基因提高准确性，因为新型冠状病毒的 N 基因和 ORF1ab 基因分别位于病毒基因组的 3' 端和 5' 端，两种基因的分工有所不同。N 基因编码核衣壳蛋白，负责病毒 RNA 包裹及颗粒组装；ORF1ab 基因则编码复制酶复合体，主导病毒复制和免疫调控。两者协同完成病毒增殖和感染，是病毒筛查的关键基因。仅 ORF1ab 或N 基因阳性提示早期感染、无症状感染或假阳性时，需进行复测评估患者的感染情况。ORF1ab 和N 基因同时阳性通常伴随明显的临床症状，是确诊新型冠状病毒感染的依据。单基因检测可能因灵敏度或病毒变异导致漏诊，故双基因联合检测是临床诊断的金标准。因此，联合检测可提升诊断的准确性。本研究结果显示，56 例疑似新型冠状病毒肺炎患者经临床诊断确诊阳性 29 例，试剂盒A、B、C、D、E 的阳性、阴性符合率均为 100%，检查结果一致性较好。在浓度 1 条件下的 N 基因检测，试剂盒 C 的批内重复性最好，而试剂盒 E 的批内 CV 最大。在浓度 1 条件下的 ORF1ab 基因检测，试剂盒 A 的批内重复性最好，而试剂盒 C 的批内 CV 最大。在浓度 2 条件下的 N 基因检测，试剂盒C 的批内重复性最好，而 B 的批内 CV 最大。在浓度2 条件下的 ORF1ab 基因检测，试剂盒 A 的批内重复性最好，而试剂盒 E 的批内 CV 最大。在浓度3 条件下的 N 基因检测，试剂盒 E 的批内重复性最好，而试剂盒 A 的批内 CV 最大。在浓度 3 条件下的 ORF1ab 基因检测，试剂盒 B 的批内重复性最好，而试剂盒 D 的批内 CV 最大。浓度 1、2 条件下，5 种试剂盒的 N 基因和 ORF1ab 基因阳性检出率一致，在浓度 3 的条件下，试剂盒 E 的 N 基因阳性检出率最高，试剂盒 B 最低；试剂盒 D 的 ORF1ab 基因阳性检出率最高，试剂盒 B 最低。5 种新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检出能力存在差异性，试剂盒 D、E 的检测能力相对更高。

综上所述，虽然 5 种试剂盒在新型冠状病毒的检测中存在差异，但其阴性、阳性符合率均较高且一致，而且在浓度 1、2 条件下，5 种试剂盒的 N 基因和 ORF1ab 基因阳性检出率一致。因此，建议在基因检测时，检测者尽量选择于浓度 1、2 条件下操作。

【参考文献】

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［3］刘冬冬，何绍平，姜亚运，等 . 新型冠状病毒核酸检测试剂盒比对研究 [J]. 现代医药卫生，2021，37（17）：2909-2911，2916.

［4］孙莉， 朱晋升， 代蕾颖， 等 . 国产新型冠状病毒IgG 抗体检测试剂盒的性能比较 [J]. 医疗卫生装备，2021，42（6）：56-59，74.

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［6］孟影，陈春峰，张小燕，等 . 2019 新型冠状病毒核酸检测试剂盒的研发与应用 [J]. 中国医药生物技术，2020，15（3）：230-234.

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［8］丁晓燕，柯志意，朱秀云，等 . 2 种国产新型冠状病毒核酸检测试剂检测结果的比较与分析 [J]. 分子诊断与治疗杂志，2020，12（3）：275-278.

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